Problémy spojené se zmrazováním a oživováním velkých savců
Při pokusech o oživení králíků a malých primátů poté, co se zastavilo srdce a dýchání a jejich periferní tkáně zmrzly při teplotách pod nulou, se objevila celá řada problémů.
První potíže se objevily během procesu chlazení. Čím je zvíře větší, tím rychleji roste jeho celková tepelná kapacita v poměru k jeho objemu ve srovnání s povrchem těla. Přenos tepla u živočicha vystaveného studenému vzduchu nebo ponořeného do studené lázně závisí na výměně energie mezi molekulami v chladném prostředí a molekulami v povrchových vrstvách a hlubších tkáních. Křeček zlatý váží jen asi 100 g a poměrně rychle vychladne.
Když byli králíci o hmotnosti 1-2 kg anestetizováni kombinací inhalace plynné směsi s vysokou koncentrací CO2 a vystavení studenému vzduchu o teplotě 0°, poté uběhly asi 18 hodiny, než se dostaly do komatózního stavu při vnitřní tělesné teplotě +23 až +3°. V této fázi srdce tlouklo přibližně 40krát za minutu a dýchání bylo hluboké – jeden nebo dva nádechy za minutu. Zvířata byla poté ponořena do tajícího ledu. Asi po 1 minutách, kdy teplota v tlustém střevě dosáhla 1-30°, se dýchání zastavilo. Srdce se obvykle stahovalo po dobu 13-18 minut, dokud teplota uvnitř těla neklesla na přibližně 5 °C. Po 10 minutách klesla teplota v tlustém střevě o další 12° a byla rovna 40-3°. Takové pomalé ochlazování musí být způsobeno nedostatečným krevním oběhem a absencí jakéhokoli pohybu v těle samotném. Okolní tekutiny byly také nehybné. Šest králíků bylo drženo v tomto stavu, tj. bez dýchání a krevního oběhu, s vnitřní tělesnou teplotou +8 až +10 °C, poté byli tito králíci zahřáti pomocí teplo emitující lampy a bylo provedeno umělé dýchání. Zvířata dočasně obnovila srdeční stahy a spontánní dýchání. Úplná obnova životních funkcí však byla pozorována pouze u jednoho králíka, ale i ten po 9 dnech uhynul.
Je dost možné, že při rychlejším a hlubším ochlazení těla zvířete by mělo být poškození organismu po zástavě dýchání a krevního oběhu méně závažné. Nejvhodnější metodou zvýšení rychlosti přenosu tepla bylo zřejmě vstřikování studených tekutin do cévního systému pomocí umělé cirkulace. Nebo by bylo možné vyplachovat pleurální a břišní dutinu studenými tekutinami. Hlavním cílem našich experimentů však bylo prozkoumat životaschopnost intaktních savců po částečném zmrazení. Svou pozornost jsme proto zaměřili na zvýšení přenosu tepla z povrchu těla zvířete. Po úplném odstranění vlny králíci mrzli mnohem rychleji, ale s obnovením dobré kondice u zvířat zcela zbavených srsti se dalo jen stěží počítat. Když byly žaludek a střeva vypláchnuty zmrzlou mléčnou směsí obsahující četné ledové krystalky, teplota uvnitř těla rychle klesla na 0°. Po zahřátí zvířat však byly v jejich trávicím traktu nalezeny závažné léze. V následujících experimentech byla břišní oblast oholena a zbývající srst byla důkladně omyta detergentem, aby se odstranily vzduchové bubliny.
Poté byli anestetizovaní králíci s vnitřní tělesnou teplotou asi +18 °C ponořeni do intenzivně míchaného 50% roztoku propylenglykolu o teplotě -5 °C. Během 10-15 minut začaly periferní tkáně mrznout a teplota v podkoží klesla na -0,5 nebo -2,5° v závislosti na místě měření. Jednu hodinu po zastavení dýchání byla teplota v tlustém střevě asi -1 °C a zůstala na stejné úrovni, což ukazuje, že přední část ledu dosáhla vnitřních orgánů těla. Do této doby periferní tkáně obsahovaly tolik ledu, že těla a končetiny zvířat ztuhly. Částečně zmrazení králíci vytvořili v těle podstatně více ledu než křečci zmrazení na stejnou dobu. V důsledku toho bylo zapotřebí více energie na zahřátí tkání celého těla a bylo nutné je co nejrychleji rozmrazit.
Zvířata jsme raději zahřívali pomocí vysokofrekvenčních proudů. K tomuto účelu jsme použili generátor pracující na frekvenci 27 MHz, o výkonu cca 500 W. V předběžných pokusech jsme opět vyzkoušeli způsob ohřevu mezi dvěma elektrodami, který jsme s úspěchem použili k oživení zmrzlých křečků. Zmrazení králíci byli umístěni do střídavého elektrického pole mezi dvě desky připojené k vysokofrekvenčnímu oscilačnímu generátoru. Nebylo však možné dosáhnout rovnoměrného rozložení elektrického pole. Výsledkem bylo, že povrchovým popáleninám bylo zabráněno pouze snížením dodávaného výkonu natolik, že rozmrazení vnitřních orgánů trvalo déle než 30 minut. U 6 takto zahřátých králíků však byly při pitvě stále pozorovány srdeční stahy. Ostatní částečně zmrzlí králíci byli zahříváni umístěním do střídavého magnetického pole, takže v tkáních vznikaly vysokofrekvenční a vysoce výkonné vířivé proudy. Tyto proudy zahřívaly celé tělo bez rizika úrazu elektrickým proudem. Zvířata byla umístěna do plexisklové trubice se stočenou měděnou trubicí kolem ní. Cívka byla připojena k vysokofrekvenčnímu zdroji střídavého proudu a sloužila jako externí rezonanční obvod naladěný na stejnou frekvenci jako generátor. V předběžných experimentech způsobily proudy procházející povrchem těla povrchové popáleniny ještě předtím, než vnitřní orgány rozmrzly. Aby se tomu zabránilo, bylo celé tělo zvířete před zahřátím otřeno ledově chlazeným detergentem a po celou dobu zahřívání bylo foukáno studeným vzduchem. V následujících experimentech byli částečně zmrazení králíci zahřáti během několika sekund a pokud bylo dodáno stejné množství tepla, teplota v tlustém střevě se zvyšovala rychlostí 16 ° za minutu. Po 1 minutách byla játra a některé další vnitřní orgány částečně „uvařené“, i když na povrchu těla nebyly žádné stopy po popáleninách.
Byla vyvinuta speciální technika, při které byli zmrazení králíci zahřáti během několika sekund, přičemž jejich vnitřní tělesná teplota stoupla z 0 na přibližně +10° za 1 minutu. Poté se snížilo množství dodávaného tepla a teplota v tlustém střevě se zvyšovala rychlostí 1–2° za 1 min. Aby se zabránilo přehřátí kůže a nadměrnému rozšíření krevních cév, bylo zvíře po celou dobu oteplování nepřetržitě ofukováno studeným vzduchem. Tímto způsobem bylo zahřáto 20 králíků, kteří byli předem zmrazeni na 40-60 minut. Jejich srdeční stahy se obnovily, jakmile teplota v tlustém střevě dosáhla přibližně +15°. Sliznice a kůže zrůžověly a zorničky se zúžily. Když teplota v tlustém střevě stoupla na 20-30°, došlo k obnovení spontánního dýchání a následně k zastavení umělé insuflace vzduchu. Pět zvířat bylo dále jemně zahříváno diatermií, dokud během několika minut neuhynulo. U 15 dalších byla diatermie přerušena, jakmile se objevilo dýchání. Povrch těla byl nadále mírně prohříván buď sálavým teplem nebo v teplém inkubátoru či vodní lázni. Někteří králíci se začali pohybovat samostatně, jeden se dokonce postavil na nohy, ale všichni zemřeli během 1-2 hodin po obnovení srdeční činnosti a dýchání. Podobné výsledky byly získány u malých lemurů Galago crassicaudatus agisymbatius. Je možné, že oteplení bylo provedeno příliš rychle, v důsledku čehož se krevní oběh a další fyziologické funkce nedokázaly přizpůsobit vzniklým podmínkám.
Jediným viditelným poškozením vnitřních orgánů zjištěným při pitvě králíků a křovin bylo těžké krvácení do fundu žaludku. Histologické vyšetření ukázalo, že tato krvácení byla omezena na část žaludku, kde jsou umístěny parietální buňky. Pylorická část žaludku, která neobsahuje buňky vylučující kyselinu chlorovodíkovou, zůstala normální. Krvácení bylo také nalezeno v žaludcích zlatých křečků resuscitovaných po částečném zmrazení nebo prodloužené zástavě srdce při teplotě jádra nad 0 °C. Tyto léze mohly být způsobeny peptickým trávením žaludeční sliznice po zástavě oběhu u chlazeného nebo částečně zmrazeného savce. Lovelock navrhl další možnost: že kyselina chlorovodíková přítomná v žaludeční dutině nebo v kanálcích žláz by mohla difundovat stěnou žaludku a poškodit jeho tkáně, včetně stěn kapilár a jiných krevních cév. Jakmile došlo k obnovení oběhu, krev vytekla z poškozených cév a další poškození bylo způsobeno čistě mechanicky. Lovelock poznamenal, že při normální tělesné teplotě žaludeční epiteliální buňky aktivně vylučují kyselinu chlorovodíkovou. Když jsou vnitřní orgány těla ochlazeny na teplotu nižší, než je teplota, při které se krevní oběh zastaví, může dojít ke ztrátě selektivní permeability v důsledku snížení intenzity metabolismu v ochlazených buňkách; Difúze při teplotách blízkých nule se zpomaluje relativně málo a ionty vodíku a chlóru se budou rychle pohybovat tkáněmi. Testovali jsme tuto teorii. Králíci a galagové byli před ochlazením 15 hodin nalačno. Obsah žaludku byl neutralizován hydrogenuhličitanem sodným bezprostředně před zástavou srdce a dýchání u již ochlazených zvířat. Poté byly přeneseny do lázně o teplotě -5° a zde udržovány, dokud teplota v tlustém střevě neklesla pod 0° a periferní tkáně postupně zamrzly (během 45 min). Poté byla zvířata zahřátá pomocí diatermie a bylo provedeno umělé dýchání, jako v předchozích experimentech. Po 2 hodinách byla zvířata usmrcena a jejich žaludky byly vyšetřeny. Nebyly nalezeny žádné známky krvácení do žaludku. Histologické vyšetření odhalilo, že žaludeční sliznici nelze odlišit od normální.
Daudet a jeho spolupracovníci již dříve vyvolali morfologicky identické žaludeční krvácení u králíků, koček, opic a dalších savců s normální tělesnou teplotou tím, že jim injektovali extrakty ze zadní hypofýzy, což způsobilo silnou vazokonstrikci. K poškození došlo při lokální ischemii a jeho závažnost závisela na kyselosti obsahu žaludku. Při neutralizaci obsahu žaludku podávání extraktů ze zadní hypofýzy nezpůsobilo krvácení do fundu žaludku. Žaludeční krvácení tedy může být způsobeno difúzí kyseliny a může mu být zabráněno neutralizací žaludečního obsahu, když se u nezmražených zvířat zastaví slizniční oběh. Získané výsledky nás utvrdily v názoru, že poškození v žaludku pokusných zvířat bylo způsobeno především kyselinou chlorovodíkovou a nikoli enzymatickým trávením, destruktivním působením ledových krystalků na sliznici nebo jakoukoli formou stresu či šoku při resuscitaci.
Prevence žaludečního krvácení prodloužila dobu zotavení u králíků a miminek, které byly po ochlazení částečně zmrazené, dokud neustalo dýchání a srdeční tep. 4 králíci z této experimentální skupiny však uhynuli do 4 hodin po resuscitaci. Dvě galagos, jejichž obsah žaludku byl neutralizován, byly zmrazeny po dobu 45–60 minut při teplotě -5 °. Jejich životní funkce byly plně obnoveny. Jedno zvíře dokonce dočasně získalo normální chování a chuť k jídlu. Oba však během 24 hodin zemřeli. Postmortální vyšetření odhalilo plicní edém, pravděpodobně v důsledku terminálního srdečního selhání z různých příčin. Je možné, že přežití bylo ztíženo některými fyziologickými nebo fyzikálně-chemickými poruchami, kterým by se dalo předejít, pokud by byly diagnostikovány.
Pokusy byly provedeny na malém počtu zvířat a získané výsledky nejsou z hlediska dlouhodobého přežití povzbudivé. Přesto již svědčí o možnosti oživení dospělých nezimujících savců, vysoce vyvinutých jako primáti, po ochlazení těla na teploty pod nulou a částečném zamrznutí tekutin v povrchových a vnitřních orgánech. Zvířata však mohou utrpět různá zranění, například poškození očí pozorované u teplých a oživených křečků.
Při projednávání problematiky zásobování teplem jsme došli k závěru, že je nepravděpodobné, že pokrok v oživování velkých savců po vymrznutí bude brzděn nedokonalými metodami rozmrazování a oteplování. Zvětšení námi navrženého diatermického aparátu a široká škála způsobů ohřevu pomocí vysokofrekvenčních proudů nepochybně zajistí dodávku dostatečného množství energie. Mnohem složitější problém je chlazení. Sotva lze doufat v objev nějakých fyzikálních látek, které by stejně jako chladivé paprsky popsané ve sci-fi románech měly opačný účinek než diatermie a zpomalily by pohyb molekul v těle. Rychlost ochlazování lze zřejmě zvýšit pouze pumpováním studené tekutiny do oběhového systému nebo výplachem pleurální a břišní dutiny. Tímto způsobem by mělo být možné snížit teplotu uvnitř těla na nulu během několika minut po zastavení dýchání. Následně je možné prodloužit dobu, po kterou zvíře zůstane životaschopné při postupném zmrazování při teplotě -5°. Pokud se k urychlení zmrazování použije umělá cirkulace, musí tekutina obsahovat látku, která zabrání jejímu zamrznutí při teplotách pod nulou. Lze použít inertní kapaliny, jako je silikon. Glycerin a podobné látky jsou také vhodné, mají další výhodu: difundují do tkání, glycerin, pokud na ně nepůsobí toxicky, chrání buňky před poškozením při zmrazování vody. Je dost pravděpodobné, že savec, který byl nebo je prokrvován takovou ochrannou tekutinou, může být ponořen do lázně nebo vystaven studenému vzduchu o teplotě hluboko pod -5°, aby se urychlil proces ochlazování bez nebezpečí omrzlin. Jakmile kůže zmrzne, její tepelná vodivost se desetinásobně zvýší. Teplota uvnitř těla však bude i nadále pomalu klesat v důsledku uvolňování latentního tepla krystalizace při zamrzání vody obsažené ve tkáních.
Doposud nebyla vyvinuta metoda perfuze jednotlivých orgánů nebo celého těla savců glycerolem, stejně jako metoda odstranění glycerolu bez poškození tkáně. Pokud by se toho podařilo dosáhnout, mohli bychom intaktní zvíře ochladit i na -70° a poté jej úspěšně oživit. A pak by bylo možné uvažovat o dlouhodobém skladování zmrazených savců. Je však třeba zdůraznit, že naděje na dosažení tohoto cíle v blízké budoucnosti je malá.
Bezprostředním úkolem je objasnit fyziologické potřeby savců zahřátých po krátkých úsecích zmrazení na tělesnou teplotu blízkou nule. To bude pravděpodobně vyžadovat studium jak složení krve, tak chování jednotlivých orgánů a systémů po ochlazení a zahřátí intaktního zvířete a provádění umělého dýchání různými metodami. V důsledku toho může být možné vyvinout vhodnou formu další léčby pro zvíře po obnovení krevního oběhu a dýchání. Účinná péče po prvotní resuscitaci nepochybně určí délku dalšího života. K úspěchu bude zapotřebí spojené úsilí týmu fyziologů, včetně specialistů na chirurgii, elektroniku, patologii, fyzikální chemii a další obory. Snad už jen stačí nějaký jednoduchý, ale nový nápad, jehož realizace zajistí úplnou obnovu životních funkcí a následný normální život savců. Tímto způsobem bude možné zachránit životy těch, kteří byli úmyslně nebo v důsledku nehody krátkodobě vystaveni ochlazení a zmrazení při vnitřní tělesné teplotě pod nulou.
Další materiály k tématu
- Neparazitární choroby kukuřice a související problémy
- Smrtelná tělesná teplota u dospělých savců. Pár klasických postřehů
- Hlavní environmentální obavy spojené s perzistentními organochlorovými pesticidy v životním prostředí
- Životaschopnost novorozených savců
- Základní výzkum hibernujících savců
- Konzervace šťáv zmrazením
- Životaschopnost zmrazených savčích testikulárních tkání
- Resuscitace savců po chladem vyvolané zástavě srdce a dýchání
- Zmrazení savčích embryonálních tkání
- Oživení savců po jejich ochlazení na tělesnou teplotu pod nulou